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Application of time-resolved fluoroimmunoassay in the detection of HBV markers. LUO Kai-zhong, YANG Xu, SU Xian-shi, XU Yun, LI Liang-you.
【Key words】 Hepatitis B virus; Polymerase chain reaction; Enzyme-linked immunosorbent assay; Fluoroimmunoassay, time-resolved
【First author抯 address】 Liver Diseases Research Center, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China
臨床工作中發現少部分經酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測僅乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和抗-HBc IgG陽性的患者，病毒含量卻很高。為此，采用時間分辨免疫熒光分析法（TRF）對34例此類患者進行乙型肝炎標志物（HBV M）的檢查，現將結果報道如下。
一、資料與方法
1. 病例選擇：為2002年2月至9月住院或門診患者，共34例，男21例，女13例，年齡5～58歲，平均（29.2±18.7）歲。采靜脈血分離血清，用ELISA進行HBV標志物（HBV M）檢測及HBV DNA定量檢查。留取血清置-30℃保存。(1)HBsAg、抗-HBc IgG陽性，乙型肝炎e抗原（HBeAg）、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc IgM陰性；(2)HBV DNA含量＞104拷貝/ml；(3)近3個月未使用抗病毒藥物。每人進行2次抗原抗體檢查，結果一致。2次HBV DNA檢查，結果相差1個數量級以下。
2. 常規HBV M檢測：用ELISA法，試劑為上海科華生物工程股份有限公司產品，按產品說明書操作。
3. HBV DNA含量測定：采用實時熒光定量PCR法，試劑盒購自廣州中山醫科大學達安基因診斷中心。儀器為美國Perkin Elmer公司GeneAmp甈E5700型PCR儀。嚴格按說明書操作，檢測靈敏度為103拷貝/ml。
4. TRF法檢查HBV M：試劑為上海新波生物技術有限公司產品，采用Anytest2000時間分辨檢測儀。嚴格按照產品說明書操作。
5. 統計分析：取HBV DNA含量的對數值進行成組設計的兩樣本均數比較，行t檢驗。
二、結果
1.HBV M：用TRF法檢查發現，34例患者中HBsAg、HBeAg、抗-HBc均陽性者15例，HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均陽性者14例，僅HBsAg、抗-HBc陽性者5例。即用ELISA檢查時HBeAg假陰性15例，抗-HBe假陰性14例(表1)。
表1 時間分辨免疫熒光發析法檢測乙型肝炎標志物結果(x-±s)
乙型肝炎標志物 參考值 樣本數 濃度 陽性例數 陽性率(%)
乙型肝炎表面抗原 0～0.5ng/ml 34 279.19±61.62 34 100.0
乙型肝炎表面抗體 0～10mU/ml 34 2.21± 5.60 0 0
乙型肝炎e抗原 0～0.03Ncu/ml 34 0.15± 0.13 15 44.1
乙型肝炎e抗體 0～1.5Ncu/ml 34 2.86± 1.29 14 41.2
乙型肝炎c抗體 0～0.1Ncu/ml 34 11.83± 4.79 34 100.0
2.HBV DNA含量：HBeAg及抗-HBc均陰性組、HBeAg陽性組、抗-HBc陽性組HBV DNA含量的對數平均值分別為6.45±1.74、7.29±1.59、5.80±1.46。將前者與后兩組分別進行成組設計的兩樣本均數比較的t檢驗，t值分別為1.005、0.816，P值均>0.05，差異無顯著性。
三、討論
HBV M的變化是評估HBV感染后病情轉歸的重要依據，也是抗病毒治療的療效考核指標之一。通過TRF檢查發現，大部分ELISA法檢測為HBsAg、抗-HBc陽性模式的患者其實為HBeAg假陰性（15/34，44.12%）及抗-HBe假陰性（14/34，41.18%）。僅少部分可能為病毒變異的結果。研究發現，HBsAg、抗-HBc濃度顯著高于正常，ELISA及TRF符合率為100%，抗-HBs濃度明顯低于正常，兩者符合率為100%。而HBeAg、抗-HBe濃度僅稍高于正常，因此ELISA易出現假陰性。目前TRF主要用于激素的檢測。隨著儀器及試劑的國產化，檢測費用的降低，TRF因其突出的高敏感性、特異性強、無放射污染等特點，在HBV M的檢測中有著廣泛的應用前景。
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